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109 | 2010
Annuaire du Collège de France 2008-2009
Résumé des cours et travaux 109e année
Équipes accueillies

Communication intercellulaire et infections microbiennes

U 971
Guy Tran Van Nhieu
p. 1099-1104

Texte intégral

Titre du programme : bases moléculaires et cellulaires de l’invasion des cellules épithéliales par shigella

Introduction

1Les bactéries entéropathogènes sont responsables de nombreux décès liés aux maladies diarrhéiques, particulièrement chez les enfants dans les pays en voie de développement. Afin d’envahir l’épithélium, les bactéries entéroinvasives induisent, lors du contact avec la membrane cellulaire, des signaux qui conduisent à des remaniements dynamiques du cytosquelette permettant leur internalisation par la cellule épithéliale. Le mode d’invasion par « triggering » implique un appareil de sécrétion spécialisé (T3SS) permettant l’injection d’effecteurs bactériens au contact cellulaire (T3S), qui agissent de l’intérieur de la cellule pour reprogrammer des voies de régulation du cytosquelette ou moduler la réponse inflammatoire [1, 2]. Ces effecteurs, de par leur action intracellulaire, représentent individuellement des «mimes » fonctionnels qui caricaturent des fonctions cellulaires endogènes et de nombreux travaux ont soulignés leur intérêt pour mettre en évidence des aspects originaux de la physiologie de la cellule.

2Shigella, l’agent de la dysenterie bacillaire, envahit la muqueuse colique et y induit une intense réaction inflammatoire. L’invasion et la dissémination de Shigella au niveau du tissu épithélial dépendent d’un T3SS. Le T3SS de Shigella permet l’injection d’une trentaine de protéines effectrices dans le cytoplasme cellulaire [3]. Une douzaine de ces effecteurs est exprimée de manière constitutive et inclut les « invasines » qui induisent les remaniements du cytosquelette nécessaires à l’internalisation des bactéries. D’autres effecteurs, qui sont régulés positivement ou exclusivement exprimés après contact cellulaire, interviennent dans le contrôle de la réponse inflammatoire. Le mécanisme conduisant à l’injection des effecteurs par le T3SS est mal compris : dans la majorité des cas, il est admis que deux protéines substrats du T3SS s’insèrent dans la membrane de la cellule hôte formant un « translocateur » permettant l’injection des protéines effectrices. Dans le cas de Shigella, les protéines IpaB et IpaC composent le « translocateur ». En addition de son rôle dans la translocation, IpaC intervient dans la signalisation lors de l’invasion bactérienne.

3Les activités de l’équipe peuvent être regroupées en quatre axes abordant la fonction des effecteurs du T3SS responsables de l’invasion, les voies de signalisation induites par ces effecteurs qui conduisent aux remaniements du cytosquelette d’actine et à l’invasion, le fonctionnement du T3SS, ainsi que la communication intercellulaire à travers les hémicanaux durant l’invasion. Dans un souci de comprendre l’intégration des fonctions de ces effecteurs lors du processus invasif, nous avons développé de techniques de microscopie et d’imagerie dynamique. Ces nouveaux angles d’approche ont permis de mettre en évidence des aspects originaux concernant la sécrétion des effecteurs de l’invasion, de la signalisation intercellulaire induite par la bactérie pathogène et du mode de reconnaissance en bactérie et cellule hôte durant les étapes initiales d’interaction.

I. Les rôles d’IpaC et d’IpgB1 dans l’induction de la polymérisation de l’actine durant l’invasion des cellules épithéliales

4Expérimentatrice principale : Joëlle Mounier (ingénieur IP)

5Nous avons montré qu’IpaC induit la polymérisation de l’actine et que cette induction nécessite le recrutement et l’activation de la tyrosine kinase Src. Différents souches de Shigella mutées pour IpaA, IgB1, ou encore IpgD, qui avaient été impliqués dans l’invasion des cellules épithéliales par Shigella, ne présentent qu’un défaut partiel d’invasion, sont toujours capables de recruter et d’activer la tyrosine kinase Src et forment des foyers de polymérisation d’actine. Par contre, nous avons montré qu’une insertion dans le domaine carboxyterminal d’IpaC en position 351, qui n’abolit pas l’injection des effecteurs par le T3SS, entraine une inhibition totale de la polymérisation de l’actine et de l’invasion de Shigella. De plus, en utilisant la toxine reombinante Iota de Clostridium difficile comme système de transport intracellulaire, nous avons montré que les 63 derniers acides-aminés carboxyterminaux d’IpaC suffisent à induire le recrutement de la tyrosine kinase Src, ainsi que des structures d’actine à la surface cellulaire rapellant des foyers d’entrée de Shigella [4].

II. Mécanisme de polarisation et d’adressage des composés du translocateur au T3SS

6Expérimentateur principal : Valentin Jaumouillé (thèse puis post-doc) 

7Nous avons montré que le stock d’IpaC présent dans le cytoplasme bactérien avant l’activation de la sécrétion se localise à un pôle de la bactérie. Cette propriété est remarquable car la majorité des protéinnes chez les E. coli sont localisées de manière diffuse [5]. Par microscopie à fluorescence sur bactéries vivantes, nous avons montré qu’IpaC est adressée rapidement à l’un des pôles au moment de la division. L’analyse des bactéries envahissant les cellules épithéliales montre qu’IpaC est injectée dans les cellules au niveau du pôle où elle est stockée. En construisant une collection de dérivés tronqués d’IpaC-GFP, nous avons identifié les domaines d’IpaC impliqués dans sa polarisation. Les propriétés de repliement de la GFP confèrent à IpaC-GFP la capacité de bloquer le T3SS. Nous avons montré que les troncations d’IpaC-GFP présentant une localisation polaire bloquent le T3SS contrairement aux troncations présentant une localisation diffuse. De plus, les troncations dans IpaC qui affectent sa localisation polaire réduisent aussi considérablement la cinétique de sécrétion par le T3SS alors que celles qui n’ont pas d’effet sur la localisation n’affectent pas la sécrétion. Ces résultats indiquent que la polarisation de substrat : i) détermine la sécrétion des T3SS au niveau du pôle bactérien au contact des cellules ; ii) semble conditionner son efficacité [5]. En addition de leurs implications dans les mécanismes régulant la signalisation au cours de l’invasion des cellules par Shigella, nous pensons que ces travaux permettront de mieux comprendre des aspects de la physiologie bactérienne sous-tendant une organisation complexe.

III. Signalisation intercellulaire dépendante des hémicanaux durant l’invasion de l’épithélium par Shigella

8Expérimentatrice principale : Caroline Clair puis Andrea Puhar (post-docs)

9Nous avons montré que l’invasion de Shigella dans les cellules exprimant des connexines (Cx) induisait la libération d’ATP dans le milieu extracellulaire par des hémicanaux [6]. L’ATP dans le milieu de culture stimule à la fois l’invasion et la dissémination de Shigella. La signalisation dépendante des hémicanaux a été très peu étudiée dans le contexte épithélial. Les cellules intestinales polarisées Caco2/TC7 expriment différent types de Cx (Cx26, Cx32 et Cx43), qui s’organisent de manière préférentielle en hémicanaux présents majoritairement au niveau des membranes basales. Nous avons produit des anticorps anti-peptide dirigés contre 2 régions conservées des boucles extracellulaires de la Cx (CELAbs) que nous avons caractérisé et utilisé comme des inhibiteurs spécifiques des hémicanaux [7]. La présence d’hémicanaux au niveau de la surface baso-latérale des cellules épithéliales intestinales polarisées suggère que la communication intercellulaire dépendante des Cxs peut également jouer un rôle dans a signalisation entre cellules épithéliales et phagocytes durant l’invasion bactérienne. L’étude de la signalisation via les hémicanaux et de son rôle dans l’activation de phagocytes par les effecteurs de type III de Shigella pourraient avoir des implications générales durant les étapes précoces de processus infectieux.

IV. Signalisation calcique et invasion de Shigella

10Expérimentateurs principaux : Jie Zheng (stagiaire M2, U 757), puis Fabienne Pierre (stagiaire M2, U 757), puis BingKai Liu (post-doc)

11En collaboration avec le Dr. Laurent Combettes de l’U 757, nous avons montré que l’expression de l’IP3-5phosphatase, qui prévient les augmentations d’IP3, conduit à une inhibition de l’invasion de Shigella. Le rôle de la signalisation dépendante de l’IP3 a également été confirmé en inhibant l’expression des récepteurs IP3 de type 1 et de type 3, correspondant aux récepteurs majoritaires de l’IP3 dans les cellules HeLa. Afin de préciser le rôle de l’IP3 durant l’invasion, nous avons mis au point un protocole basé sur l’incubation dans un milieu dépourvu de calcium combiné à un traitement avec la thapsigargine, un inhibiteur de la calcium-ATPase du réticulum endoplasmique, pour montrer que l’invasion des cellules par Shigella pouvait se produire en absence de réponse calcique globale. Ces résultats suggèrent que via l’IP3, des réponses calciques locales sont impliquées dans l’invasion des cellules par Shigella. L’analyse de telles réponses locales, qui implique la mise au point d’une station de microscopie dédiée à l’acquisition très rapide et quantitative de signaux fluorescents, est actuellement en cours et le matériel requis utilisé en prêt fait l’objet de demandes de financement (non publiés).

V. Caractérisation de micropodes impliqués dans la capture précoce des bactéries

12Expérimentateurs principaux : Gianfranco Grompone, puis Stéphane Romero (post-docs), Alessia Quatela (Post-doc, UMR CNRS 168) 

13Nous avons montré que la signalisation dépendante de l’ATP extracellulaire et des hémicanaux stimule la capture des bactéries par des extensions filopodiales (NMEs) et l’invasion des cellules épithéliales (non-publiés). Dans le cas de bactéries invasives, la capture par les NME et suivie de leur rétraction vers le corps cellulaire où l’invasion est déclenchée. Nous avons pu modéliser la capture de Shigella avec des billes recouvertes de fractions de membranes de Shigella M90T ou mxiD. Seules les billes M90T sont rétractées vers le corps cellulaire par les extensions membranaires. Ce résultat suggère que le T3SS est impliqué dans la rétraction de Shigella par les NMEs. Nos résultats préliminaires indiquent que des anticorps dirigés contre IpaB inhibent la capture de Shigella par les NMEs, alors que des anticorps dirigés contre IpaC ou IpaA n’ont pas d’effets. Ces résultats supporteraient le modèle du « pré-tanslocon » selon lequel les protéines IpaB et IpaD seraient localisées à l’extrémité de l’aiguille du T3SS avant même l’induction de la sécrétion.

14Pour visualiser le comportement du cytosquelette dans les extensions membranaires au cours de a rétraction, nous avons micro-injecté de l’actine préalablement marquée covalemment à la rhodamine. Cette expérience montre que ces extensions membranaires sont riches en actine. Nous étudions actuellement la dynamique des filaments d’actine au cours de la formation des extensions membranaires et de la rétraction suite à la capture. Nous avons aussi observé que de faibles quantités de cytochalasine D (qui coiffent partiellement les filaments d’actine dans la gamme de concentration que nous utilisons) augmentent le nombre et la longueur des extensions membranaires. Ces résultats confirment le rôle de la polymérisation de l’actine dans la dynamique d’extension / rétraction des extensions.

15Dans le cadre de projets ANR financés en 2005 et 2008 et en collaboration avec Patricia Bassereau, nous caractérisons les paramètres biophysiques des NMEs à l’aide de pinces optiques. Nous avons reproduit la capture par les NMEs en utilisant des billes d’une taille similaire aux bactéries, recouvertes avec des membranes isolées de souches de Shigella invasives ou avec des peptides purifiés. Cette section aborde des aspects nouveaux des interactions entre bactéries pathogènes et la cellule hôte, qui pourraient être étendus à d’autres systèmes bactériens d’adhérence ou d’invasion.

Références

16[1] Cossart P. & Sansonetti P.J., « Bacterial invasion : the paradigms of enteroinvasive pathogens », Science, 304, 2004, 242-248.

[2] Cornelis G.R., « The type III secretion injectisome », Nat. Rev. Microbiol., 4, 2006, 811-825.

[3] Parsot C., « Shigella type III secretion effectors : how, where, when, for what purposes? », Curr. Opin. Microbiol., 12(1), 2009, 110-6.

[4] Mounier J., Popoff M.R., Enninga J., Frame M.C., Sansonetti P.J. & Tran Van Nhieu G., « The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells », PLoS Pathog., 2009 (sous presse).

[5] Jaumouillé V., Francetic O., Sansonetti P., Tran Van Nhieu G., « Cytoplasmic targeting of IpaC to the bacterial pole directs polar type III secretion », Shigella. EMBO J.,27, 2008, 447-457.

[6] Tran Van Nhieu G., Clair C., Bruzzone R., Mesnil M., Sansonetti P., Combettes L., « Connexin-dependent intercellular signaling increases Shigella invasion and dissemination in epithelial cells », Nature Cell. Biology, 8, 720-726.

[7] Clair C., Combettes L., Pierre F., Sansonetti P., Tran Van Nhieu G., « Extracellular-loop peptide antibodies reveal a predominant hemichannel organisation of connexins in polarized intestinal cells », Experimental Cell. Research, 2008.

Publications

Publications originales dans des revues à comité de lecture

17Jaumouillé V., Francetic O., Sansonetti P., Tran Van Nhieu G., « Cytoplasmic targeting of IpaC to the bacterial pole directs polar type III secretion in Shigella », EMBO Journal., 2, 2008, 447-457.

Clair C., Combettes L., Pierre F., Sansonetti P., Tran Van Nhieu G., « Extracellular-loop peptide antibodies reveal a predominant hemichannel organisation of connexins in polarized intestinal cells », Experimental Cell. Research, 2008.

Mounier J., Popoff M.R., Enninga J., Frame M.C., Sansonetti P.J., Tran Van Nhieu G., « The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells », PLoS Pathog., 2009 (sous presse).

Viklund I.M., Aspenström P., Meas-Yedid V., Zhang B., Kopec J., Agren D., Schneider G., D’Amato M., Olivo-Marin J.C., Sansonetti P., Tran Van Nhieu G., Pettersson S., « WAFL, a new protein involved in regulation of early endocytic transport at the intersection of actin and microtubule dynamics », Exp. Cell. Res., 2009 (sous presse).

Dupont N., Lacas-Gervais S., Bertout J., Paz I., Freche B., Tran Van Nhieu G., van der Goot G., Sansonetti P., Lafont F. « Shigella phagocytic vacuolar membrane remnants participate in the cell signaling response to pathogen invasion », Cell. Host. Microbes, 2009 (sous presse).

Publications de revue dans des revues de spécialité à comité de lecture

18Jaumouillé V., Francetic O., Sansonetti P.J.,Tran Van Nhieu G., « Polarization and bacterial type III secretion », Microbe, 2008 (sous presse).

Tran Van Nhieu G., Guignot J., « When Shigella tells the cell to hang on », Journal of Molecular and Cellular Biology, 2009 (sous presse).

Tran Van Nhieu G. & Arbibe L., « Genetic reprogramming of host cells by bacterial pathogens », F1000 report, 2009 (sous presse).

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Pour citer cet article

Référence papier

Cours et travaux du Collège de France. Annuaire 109e année, Collège de France, Paris, mars 2010, p. 1099-1104. ISBN 978-2-7226-0083-6

Référence électronique

Guy Tran Van Nhieu, « Communication intercellulaire et infections microbiennes », L’annuaire du Collège de France [En ligne], 109 | 2010, mis en ligne le 25 juin 2010, consulté le 26 octobre 2014. URL : http://annuaire-cdf.revues.org/460

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Auteur

Guy Tran Van Nhieu

Responsable de l’équipe « Communication intercellulaire et infections microbiennes » accueillie au Collège de France (DR2 Inserm)

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